寡核苷酸藥物純化“精”要：從雜質特性到填料選型

2025-06-07 12:15:16 28閱讀次數

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在寡核酸藥物的合成過程中，包括磷酸骨架、糖環、堿基在內的眾多點位均有可能產生不同種類的產品相關雜質（Process-related impurity，PRI），例如N-X，N+Y，PO雜質，脫嘌呤雜質等（圖1）；且受單步反應效率、空間位阻等限制因素的影響，隨著合成鏈長的增加，對應的雜質含量也會顯著提升。

圖1：寡核酸藥物常見產品相關雜質（Capaldi et al.）

層析步驟是控制產品相關雜質的關鍵工藝環節，而層析工藝開發的核心在于掌握并利用不同類型雜質與藥物活性成分（API）的性質差異，常見的可能影響樣品層析行為的性質差異主要包括以下幾類：

帶電基團：寡核酸所帶靜電荷取決于磷酸或修飾基團的數目，堿基的數目以及二級結構是否遮蔽帶電基團；在變性條件下打開氫鍵使結構舒展并使堿基不帶電，有助于區分N-X雜質。

DMT基團：三苯甲基是一個強疏水基團，可與反相/疏水填料產生相互作用；可以根據是否帶有DMT基團對全長序列進行分離。

硫醇化（Thiolation）：當磷酸基團中的氧原子被硫原子取代時，帶負電的基團極性增加，在大多數pH條件下與陰離子交換填料結合力更強。

甲基化（Methylation）：當氧原子被甲基取代時，疏水增強。

脫嘌呤（Depurination）：過度的酸性暴露會導致嘌呤堿基與脫氧核糖之間的斷裂，在一定pH條件下會改變分子電荷與疏水性。

不難發現，寡核酸藥物的層析純化實際上主要依賴的是API與PRI分子之間電荷與非極性基團的數量差異。根據合成結束后是否保留DMT基團以及是否選擇柱上脫保護，可分別選擇以下四種純化路線：

圖2：寡核酸藥物純化工藝路線與相關填料

陰離子交換（AEX）是寡核酸藥物首選的層析工藝之一，因其載量相對較高，且針對N-X雜質具有良好的去除能力，能夠滿足大部分項目的純化需求。

但是對于雜質含量高或者純度要求高的項目，單步AEX有時難以達到工藝目標，這種情況通常需要引入反相（RPC）或疏水（HIC）層析。

但是，常規的RPC工藝需要大量使用有機溶劑，這不僅要求設備車間有防爆設計，且后期廢液處理成本也較高。在工藝開發階段，可評估HIC層析的分離效果；由于DMT-on序列的疏水性主要來自單個DMT基團，所以在HIC填料配基的選擇上主要傾向于苯基等高疏水性基團，如Capto Phenyl, Capto Phenyl ImpRes等。

在滿足純化要求的情況下，HIC工藝基本不使用有機溶劑，可有效降低純化成本。

由于寡核酸雜質與目標物之間通常僅有幾個基團的細微差異，這就要求填料能夠提供足夠高的分辨率以保證良好的產品純度與收率。如圖3所示，分辨率的高低一方面體現在相鄰色譜峰保留時間的差異（選擇性），另一方面體現在色譜峰的峰寬（有效性）。