過氧亞硝酸根（ONOO^-）是一種具有強氧化和硝化能力的活性氧和氮物種（RONS），在生物體系中通過一種快速的擴散控制反應(yīng)形成，該反應(yīng)涉及兩種自由基——一氧化氮（?NO）和超氧陰離子（O₂^-），且不需要酶催化。在正常濃度下，ONOO^- 能夠維持氧化還原平衡，并作為信號分子通過硝化酪氨酸殘基來調(diào)節(jié)神經(jīng)信號傳導(dǎo)途徑。然而，ONOO^- 的過度產(chǎn)生可能導(dǎo)致阿爾茨海默?。ˋD）中的氧化應(yīng)激和神經(jīng)退行性變，繼而引起脂質(zhì)、核酸、酶和蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能變化，這被認為是早期AD診斷的潛在生物標記物。

當前，已有多種分析方法被用于檢測ONOO^-，包括電子自旋共振、比色法、電化學、液相色譜-質(zhì)譜和熒光分析等。其中，熒光分析檢測方法因其特異性、靈敏度、非侵入性和實時監(jiān)測的優(yōu)勢而受到廣泛關(guān)注，被認為是生物系統(tǒng)中感測和成像ONOO^- 的理想選擇。

迄今為止，許多 ONOO^- 熒光探針都是依靠不同的反應(yīng)模式開發(fā)出來的，例如硫化物的氧化、硼酸或硼酸酯的氧化、C-C雙鍵的斷裂、氧化性N-脫芳基化等，但ONOO^- 熒光探針在實際應(yīng)用中仍存在一些挑戰(zhàn)：（1）ONOO^- 與其質(zhì)子化形式ONOOH（pKa = 6.8）處于平衡狀態(tài)，在生物體系中半衰期極短（約10毫秒），需要探針具有超快的響應(yīng)速度以滿足實時監(jiān)測的需求；（2）探針必須具有良好的水溶性和低毒性，才適合在復(fù)雜的生物體系中應(yīng)用；（3）探針需要對ONOO^- 具有高度選擇性，以避免其他ROS/RNS的干擾，尤其是與ONOO^-反應(yīng)性類似的HO；（4）探針應(yīng)具有大的斯托克斯位移和長波長發(fā)射的特點，以滿足AD模型中高分辨率和深層成像的需求；（5）在AD大腦中成像ONOO^-需要探針能夠穿透血腦屏障（BBB）。

在本研究中，作者設(shè)計并合成了兩種新型熒光探針NBD-Y和NBD-I，它們利用ONOO^- 氧化斷裂C-N單鍵的能力來感測和成像體外和體內(nèi)的ONOO^-。通過對光物理性質(zhì)的系統(tǒng)研究，證明NBD-Y和NBD-I具有高靈敏度（檢測限分別為11和45納摩爾）、高水溶性（DMSO/PBS = 1:199, v/v）、優(yōu)異的選擇性和對ONOO^- 的快速響應(yīng)（3秒內(nèi)）。其中，NBD-Y成功在活細胞中可視化ONOO^-，具有良好的細胞膜滲透性和低細胞毒性。此外，NBD-Y還可以用于成像AD大腦中的內(nèi)源性過氧亞硝酸根，具有良好的BBB穿透性。這些結(jié)果不僅表明NBD-Y作為監(jiān)測過氧亞硝酸根的敏感和可靠探針具有潛力，還可能指導(dǎo)設(shè)計用于多個AD模型中ONOO^- 的新型近紅外、雙光子和比率熒光探針。

文中應(yīng)用了生物科技有限公司AniView多模式動物活體成像系統(tǒng)分別拍攝了小鼠ONOO^-活體水平和器官水平的熒光成像。結(jié)果顯示，WT小鼠腦內(nèi)熒光在0 ~ 1h ( Fmax / F0 = 3.89)內(nèi)顯著增加，2 ~ 4h內(nèi)保持穩(wěn)定。相比之下，APP/PS1小鼠組僅觀察到微弱的熒光增強( Fmax / F0 = 1.33 , Fmax和F0分別代表3h和0h時小鼠腦內(nèi)的熒光強度)。前面體外實驗證實AD組和WT組熒光強度的差異主要是由于探針與被激發(fā)的ONOO^-之間的反應(yīng)。三組小鼠的心臟、肝臟、脾臟、肺和腎臟中幾乎觀察不到熒光，但在其大腦中檢測到明顯的熒光變化。這些器官的離體成像結(jié)果表明，WT組和姜黃素（CUR）藥物處理組的大腦中的熒光強度遠高于AD組，證明探針可以穿過血腦屏障并在大腦中檢測到ONOO^-。這些結(jié)果證明ONOO^-的過度表達是阿爾茨海默病的明顯標志，并且NBD-Y可以有效地檢測大腦中ONOO^-的表達水平。