一、染色質開放研究技術發展史
 

ATAC-seq作為表觀組學研究技術之一，已經被很多組學專家所接受并已經在應用，那關于ATAC-seq技術，你了解多少呢？

要介紹ATAC-seq，不得不提到它的發展史。在染色質開放性研究領域，也是走了一段長長的路，這也是一條長江后浪推前浪的路。

DNase-seq：這項技術屬于開放染色質研究的老前輩，它的開發主要是因為染色質區域有很多DNase I HS位點，DNase-seq依賴于DNaseI核酸酶的消化來識別核小體耗盡的開放染色質區域，在那里所有類型的因子都有結合位點，但它不能識別哪些特定的因子被結合【1】。

FAIRE-Seq：FAIRE-Seq的技術開發，其實是在經典DNA-蛋白互作技術ChIP-seq的基礎上的技術衍生及應用。2007年，FAIRE-seq技術正式問世，它傳承了ChIP-seq的甲醛交聯和超聲打斷，所以整個實驗操作時間周期較長，也有一定的實驗困難【2-3】。

MNase-Seq也是在ChIP-seq的基礎上進行的發展，MNase酶的應用也是在ChIP技術中替代超聲的步驟時使用的。MNase-Seq技術是在應用FAIRE-seq時有理有據的迭代更新【4】。

ATAC-seq技術的發展得益于Tn5轉座酶的研究，Tn5轉座酶的應用，大大簡化了開放染色質研究的時間，從最初2-3天的實驗周期，縮短到2-3小時【5】。
 

圖：不同染色質開放性研究技術對比，圖片來源：Lee B. H. et al. 2021
 

Tn5酶的出現，確實是改變了表觀技術研究的應用，ATAC-seq技術問世以來，大量的樣本獲得了較好的開放染色質區域的信息，轉錄因子調控更上一層樓。但是，Tn5酶最初的應用，不是在開放染色質研究，而是在DNA文庫構建時的酶切片段化，Tn5酶的應用，使得超低濃度DNA建庫成為可能，低至1ng的樣本都能很好的建庫。
 

圖：基于Tn5酶的建庫流程
 

二、ATAC-seq技術研究要點？
 

但是在應用時，我們會發現，常規Tn5建庫試劑盒，明明是55℃酶切，為什么在進行ATAC-seq研究時，溫度就變成了37℃？能不能也進行55℃酶切？實際情況是37℃和55℃都是可以酶切實驗，只是在55℃時，有些樣本的開放狀態可能會有影響，造成后續數據分析時背景噪音較高【7】，而37℃進行實驗時，背景噪音普遍較低。當然，我們在真實實驗時，也會發現有些樣本37℃酶切效果不好時，也是可以考慮改變酶切溫度。
 

除了以上介紹的內容，關于ATAC-seq，到底是在研究什么？數據分析時，要重點關注什么呢？

首先我們從ENCODE上公布的ATAC的數據質量標準來看看關注點：

1）實驗需要設置至少2個生物學重復；對無法做生物學重復的樣本至少2個技術重復

2）每個實驗組需要有單端測序時15 M的clean reads或者雙端測序50 M clean reads；

3）mapping率應最低80%；

4）用IDR值評判重復性；

5）NRF>0.9, PBC1>0.9, and PBC2>3評估文庫復雜性；

6）peak數50000以上；

7）文庫需呈現核小體pattern，至少需要有核小體free的區域展現；

8）FRiP值需大于0.2；

9）TSS分布圖來判斷背景信號。

總的來說，就是在文庫構建之后，需要對文庫進行庫檢，文庫需要符合核小體pattern，即呈現出linker峰、一個核小體峰、兩個核小體峰等等，然后測序量需要達到要求，另外，測序后的數據分析，peak數是一個評價標準，最后就是TSS分布圖來評估背景。
 

拿到ATAC-seq測序數據之后，我們要去關注什么？ATAC-seq的結果，通常會分兩大類，一類是核小體定位，一類是轉錄因子。發展到現在，關注轉錄因子的群體越來越多，通過獲得的peak進行motif分析，然后預測motif對應的轉錄因子來進行后續的研究。當然，基于開放染色質區域通常是基因的啟動子調控區域，所以將染色質開放區與基于的表達情況進行關系分析，即ATAC-seq+RNA-seq進行關聯分析，來找尋關鍵的轉錄因子調控的關鍵靶基因。 

當然了，ATAC-seq聯合Hi-C以及組蛋白修飾的數據進行增強子鑒定，又是另外一個故事了。

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參考文獻：
[1] Boyle A P ,  Davis S ,  Shulha H P , et al. High-Resolution Mapping andCharacterization of Open Chromatin across the Genome[J]. Cell, 2008, 132(2):311-322.

[2] Giresi P G ,  Kim J ,  Mcdaniell R M , et al. FAIRE (Formaldehyde-Assisted Isolation of Regulatory Elements) isolates active regulatory elements from human chromatin[J]. Genome Research, 2007, 17(6):877-885.

[3]Jeremy, M, Simon, et al. Using formaldehyde-assisted isolation of regulatory elements (FAIRE) to isolate active regulatory DNA.[J]. Nature protocols, 2012.

[4] Pajoro A , JM Muiño,  Angenent G C , et al. Profiling Nucleosome Occupancy by MNase-seq: Experimental Protocol and Computational Analysis[J]. Methods in Molecular Biology, 2017.

[5] Buenrostro J D ,  Wu B ,  Chang H Y , et al. ATAC-seq: A Method for Assaying Chromatin Accessibility Genome-Wide[J]. Current Protocols in Molecular Biology, 2015, 109(1).

[6] Lee B H ,  Rhie S K . Molecular and computational approaches to map regulatory elements in 3D chromatin structure[J]. Epigenetics & Chromatin, 2021, 14(1).

[7] Zhang H ,  Rice M E ,  JW  Alvin, et al. Extensive evaluation of ATAC-seq protocols for native or formaldehyde-fixed nuclei[J]. BMC Genomics, 2022, 23(1):1-18.