Qube 384使用穿孔膜片鉗技術(shù)優(yōu)化hiPSC心肌細(xì)胞動(dòng)作電位記錄

來(lái)源：丹麥索菲恩生物科技有限公司上海代表處      分類：應(yīng)用方案 2025-05-30 17:30:15 10閱讀次數(shù)

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Qube 384使用穿孔膜片鉗技術(shù)

優(yōu)化hiPSC心肌細(xì)胞動(dòng)作電位記錄

心血管疾病（CVD）每年導(dǎo)致全球約1800萬(wàn)人死亡（占全球總死亡人數(shù)的32%），其中心律失常是重要誘因。hiPSC-CMs是研究疾病機(jī)制和藥物篩選的理想模型，而膜片鉗技術(shù)是評(píng)估心肌細(xì)胞電生理狀態(tài)的“金標(biāo)準(zhǔn)”。動(dòng)作電位的形態(tài)和時(shí)程由多種離子通道的協(xié)同活動(dòng)決定，其異常可導(dǎo)致疾病的發(fā)生和發(fā)展。因此，準(zhǔn)確記錄動(dòng)作電位對(duì)心臟疾病研究和藥物開(kāi)發(fā)至關(guān)重要。

穿孔膜片鉗技術(shù)通過(guò)添加制霉菌素（nystatin）在膜上形成微孔，既能實(shí)現(xiàn)電生理記錄，又能保留胞內(nèi)生理環(huán)境。傳統(tǒng)全細(xì)胞記錄模式是通過(guò)形成緊密封接后破膜去記錄細(xì)胞膜表面的電信號(hào)，這可能導(dǎo)致胞內(nèi)成分流失，影響鈣緩沖系統(tǒng)，從而縮短動(dòng)作電位時(shí)程（尤其是早期復(fù)極階段）。與傳統(tǒng)的 全細(xì)胞（WC）膜片鉗記錄不同，穿孔膜片鉗技術(shù)中膜片孔內(nèi)的膜片保持完整。在本研究中，將一種成孔劑添加到細(xì)胞內(nèi)溶液 (IC溶液) 中，該成孔劑隨后插入膜片并形成孔隙（圖1）。這使得電流能夠進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，同時(shí)保留其生理成分 。

方法與結(jié)果

穿孔膜片鉗和全細(xì)胞電記錄模式的生理參數(shù)對(duì)比

電生理參數(shù)測(cè)定結(jié)果顯示，兩個(gè)測(cè)定組中，兩組的膜電容（C???）無(wú)顯著差異，但穿孔膜片鉗細(xì)胞的膜電阻（R???）和串聯(lián)電阻（R????）與全細(xì)胞模式存在顯著差異（表1）。穿孔膜片鉗雖降低封接質(zhì)量，但更接近真實(shí)細(xì)胞狀態(tài)。

Na?電流的QChip分布圖

制霉菌素（nystatin）是一種常用作成孔劑的多烯類抗生素。它僅對(duì)小分子單價(jià)離子具有滲透性，且陽(yáng)離子優(yōu)先于陰離子。當(dāng)將F-離子添加到IC溶液中作為封接增強(qiáng)劑時(shí)，F(xiàn)-離子進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)區(qū)的程度會(huì)較小，從而最大限度地減少細(xì)胞內(nèi)Ca2+的沉淀。然而，nystatin會(huì)干擾封接的形成。因此必須在細(xì)胞使用封接增強(qiáng)劑注形成緊密封接后，再通過(guò)更換細(xì)胞內(nèi)液加入。在初始記錄中，全細(xì)胞組（列1-6）多數(shù)細(xì)胞顯示Na?電流（綠色），穿孔組（列11-24）僅5%自發(fā)轉(zhuǎn)為全細(xì)胞。在替換細(xì)胞內(nèi)液添加制霉菌素后，穿孔組50%細(xì)胞出現(xiàn)Na?電流（微孔形成）。加入QX314（NaV通道細(xì)胞內(nèi)阻斷劑，無(wú)法通過(guò)制霉菌素孔道進(jìn)入細(xì)胞）后，QX314溴化物可阻斷全細(xì)胞模式的Na?電流（紅色），但因無(wú)法通過(guò)制霉菌素微孔，穿孔膜片鉗細(xì)胞的Na?電流不受影響（綠色）。

Na?電流動(dòng)態(tài)變化

穿孔組電流比例從5%（初始）升至53%（nystatin后），最終40%維持電流。

動(dòng)作電位（AP）參數(shù)分析

穿孔組25%細(xì)胞APD??>100 ms，全細(xì)胞組僅10%。穿孔組的APD??比全細(xì)胞組長(zhǎng)60%，且隨培養(yǎng)時(shí)間（DIV）延長(zhǎng)而增加，提示鈣電流密度隨細(xì)胞成熟提升。這表明，穿孔膜片鉗記錄的AP更接近生理狀態(tài)，尤其保留鈣通道對(duì)平臺(tái)期的影響。

Ca?電流對(duì)比

穿孔組實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，71%細(xì)胞記錄到Ca?電流（幅值更高），電流密度隨電壓升高而增加（圖6A）。而全細(xì)胞組：僅4%細(xì)胞檢測(cè)到Ca?電流，幅值低（圖6C）。全細(xì)胞模式因Ca2?被氟化物（KF）沉淀而削弱鈣電流的問(wèn)題，可通過(guò)穿孔技術(shù)顯著改善。

結(jié)論

穿孔膜片鉗技術(shù)顯著提升了hiPSC-CMs動(dòng)作電位和鈣電流記錄的生理相關(guān)性，為心臟疾病機(jī)制研究和藥物篩選提供了更可靠的工具。未來(lái)可嘗試改用短桿菌肽（gramicidin）進(jìn)一步優(yōu)化鈣電流測(cè)量。

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