本文對比差式掃描量熱法（DSC）與差式掃描熒光法（DSF）兩種表征生物大分子高級結構穩定性常用技術，幫助您了解兩種技術的異同點，在評估各類生物大分子的穩定性時可以選擇合適的分析工具。

評估生物大分子的穩定性至關重要，因為這直接關系到其在藥物開發、疾病診斷、治療以及基礎生物學研究中的應用前景和實際效能。穩定性的評估能夠確保生物大分子在制備、存儲、運輸及應用過程中保持其結構和功能，從而發揮預期的生物學活性，提高生物產品的療效和安全性。此外，穩定性數據對于優化生物大分子的生產和純化過程、延長其貨架壽命、減少成本以及推動科學研究的深入都有著不可或缺的作用。

在生物技術藥物開發的“質量源于設計”(QbD) 方法中，穩定性表征是所有候選藥物的“開發可行性”和“成藥性”評估以及流程開發和生產的一部分。穩定性數據還整合到用于生產支持、生物技術藥物可比性和生物相似性評估的高級結構 (HOS) 表征和“指紋圖譜”中。

由于生物大分子結構十分復雜，生物物理工具在生物制藥產品的完全表征中非常重要。評估生物大分子穩定性的生物物理工具多種多樣，其中差示掃描量熱法（DSC）與差示掃描熒光法（DSF）是表征生物大分子高級結構穩定性的常用技術，本文主要聚焦兩種技術的異同點，旨在幫助大家選擇合適的技術評估各類生物大分子的穩定性。

DSC 與 DSF，一字之差，大有不同

01丨測試原理

DSC：溶液中生物大分子以恒定加熱速率由自然（折疊）到變性（展開），此過程涉及非共價鍵的斷裂為吸熱過程，DSC可以實時監測生物分子隨溫度變化而發生的熱容（Cp）改變，通過對數據的處理（如積分）可以獲取如Tm值、Tonset、ΔH、ΔCp等熱力學信息。

DSF：溶液中生物大分子以恒定加熱速率/不同變性劑條件下由自然（折疊）到變性（展開），DSF可以實時監測由于色氨酸從疏水到親水環境所導致的發射波長改變/由于疏水區域暴露和環境敏感的疏水染料結合導致的熒光變化，進而獲取Tm、Tonset等參數。

02丨適用樣品類型

DSC：由于DSC是監測維系生物分子高級結構非共價鍵斷裂的熱量吸收，所以對于蛋白、核酸、脂質等各類分子都適用。

DSF：由于DSF是監測色氨酸或疏水區暴露所引起的發射波長或熒光信號的變化，所以測試樣品需有豐富的色氨酸/疏水區，DSF僅適用某些蛋白樣品，不適用于核酸、脂質等樣品。若測試前蛋白已有部分變性（疏水區暴露）或樣品中含有去垢劑，則會造成較強的背景熒光。

03丨相關參數含義（Tm、ΔHcal）

DSC：通過DSC測試所得到的Tm（熱轉變中點溫度）為體系中50%生物分子變性對應的溫度，即峰值所對應的溫度；ΔHcal為每摩爾蛋白變性所吸收的熱量，一般用于衡量體系中生物分子的活性含量。

DSF：通過DSF測試得到的Tm值為體系中50%色氨酸/疏水區暴露時所對應的溫度，色氨酸/疏水區的暴露無法真實的反應蛋白變性過程，同時無法獲得ΔH等樣品活性信息。

04丨應用

DSC：由于DSC具有良好的重復性，適合批間一致性分析和生物相似性打分分析；同時DSC具有結構域級分辨率（可區分抗體CH2、CH3、Fab區域），適用于抗體等多個結構域樣品的穩定性評估。

DSF：DSF的重復性較差，難以進行定量分析，但分析速度較快，適合穩定性的快速初步篩選。

05丨DSC 應用示例

DSC在核酸分析中的應用

與傳統的小分子藥物和抗體藥物相比，核酸藥物可針對不可成藥靶點、無需復雜蛋白生產工藝、具有設計簡便、研發周期短、靶向特異性強、治療領域廣泛和長效性等優點，目前在遺傳疾病、腫瘤、病毒感染等疾病的治療上應用廣泛，有望成為繼小分子藥物和抗體藥物后的第三大類藥物。然而，由于核酸藥物本身攜帶負電、容易降解等問題，導致其穩定性差、半衰期短、遞送效率低，因此需要經過化學修飾或者是遞送系統達到長期有效的治療效果。DSC可以非常靈敏的反應出核酸化學修飾前后穩定性的差異，然而其他穩定性分析技術可能無法反應出這些微小的變化。

DSC用于分析鎖核酸（LNA）摻入核酸的影響

鎖核酸（LNA）是一種經過修飾的RNA，LNA中一部分核糖上的2‘與4’碳連結在一起，降低了核糖結構的柔韌性，進而增強磷酸鹽骨架的局部結構的穩定性。該應用利用DSC技術研究了LNA的摻入對DNA、RNA異源雙鏈體雜交熱力學的影響。LNA修飾后，峰圖明顯向右偏移；同時，隨著LNA修飾個數的增加，Tm值逐漸升高，表示雜交體的穩定性因LNA的摻入變得更加穩定。

DSC用于表征mRNA-LNP

通過PEAQ-DSC提供的LNP熱力學指紋圖譜，可以對比游離mRNA、mRNA-LNP以及LNP的穩定性變化（圖2）。從圖中來看，mRNA組裝于LNP之后，Tm增大，表明mRNA-lipid產生相互作用之后，能穩定彼此結構，使得mRNA-LNP組裝更穩定。

與DSF技術相比，DSC技術具有多方面優勢，因此被公認為是生物制藥行業中熱穩定性試驗的金標準技術：

• 無需標記，適用樣品類型更豐富，且不受熒光背景及buffer成分干擾；

• 更寬的溫度范圍，適用具有較高Tm的樣品；

• 提供除Tm之外豐富的熱力學信息；

• 全局測定技術，具備高分辨率、高重復性，可分辨多結構域樣品；

如果您分析的樣品為不含色氨酸的蛋白樣品或其它非蛋白樣品，或是要進行精細的蛋白設計與改造、候選物篩選、配方優化、可比性相似性評估等多種應用，DSC都將是您的最優選擇！