產(chǎn)品簡(jiǎn)介

江苑生物的全套三代慢病毒包裝質(zhì)粒（四質(zhì)粒系統(tǒng)）包括3種包裝輔助質(zhì)粒：pMD2.G、pMDLg/pRRE和pRSV-Rev，均為氨芐抗性，用于包裝三代慢病毒載體質(zhì)粒。

此包裝質(zhì)粒系統(tǒng)表達(dá)病毒包裝需要的各種必需成分如：gag基因，編碼病毒的核心蛋白如基質(zhì)蛋白、衣殼蛋白和核衣殼蛋白等；pol基因，編碼病毒復(fù)制所需的酶如反轉(zhuǎn)錄酶、整合酶和蛋白酶；rev基因，編碼調(diào)節(jié)gag和pol基因表達(dá)的調(diào)節(jié)因子；還含有單純皰疹病毒來源的VSV-G基因，提供病毒包裝所需要的包膜蛋白。江苑生物的慢病毒包裝系統(tǒng)產(chǎn)生的慢病毒感染目的細(xì)胞后不會(huì)再感染其他細(xì)胞，也不會(huì)利用宿主細(xì)胞產(chǎn)生新的病毒顆粒。慢病毒中的毒性基因已經(jīng)被剔除并被外源性目的基因所取代，屬于假型病毒。本司還提供慢病毒包裝試劑盒（江苑生物 JY03021），包含全套的包裝組分和試劑。為了加速科研進(jìn)程，本司還提供細(xì)胞基因過表達(dá)、shRNA/siRNA介導(dǎo)的基因沉默、CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因敲除等服務(wù)。

慢病毒包裝原理、包裝質(zhì)粒的選擇、包裝系統(tǒng)和包裝步驟請(qǐng)參考：江苑生物→新聞中心

產(chǎn)品組分

保存條件

干冰運(yùn)輸。-20℃保存，避免反復(fù)凍融。

注意事項(xiàng)

1．質(zhì)粒濃度由Thermo的NANODROP ONE測(cè)定，不同的儀器測(cè)出的濃度可能會(huì)有輕微差異。

2．本產(chǎn)品僅用于科學(xué)研究。

3．為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

使用說明

1．本品為高純度、無(wú)內(nèi)毒素、無(wú)污染物的質(zhì)粒，溶于ddH2O中。其中1 μg包裝的質(zhì)粒濃度為100 ng/μL，共10 μL；100 μg包裝的質(zhì)粒濃度為1000 ng/μL，共100 μL，使用時(shí)根據(jù)實(shí)際需求進(jìn)行稀釋，分裝凍存。

2．若購(gòu)買1 μg包裝的質(zhì)粒，S次使用時(shí)請(qǐng)先取少量本質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌，進(jìn)行質(zhì)粒小量、中量或大量抽提后再用于后續(xù)用途。抽提獲得的質(zhì)粒可以通過電泳或測(cè)序進(jìn)行鑒定。若想省去擴(kuò)增和鑒定步驟，可直接購(gòu)買100 μg包裝的質(zhì)粒。

3．pMD2.G、pMDLg/pRRE、pRSV-Rev及慢病毒載體質(zhì)粒，構(gòu)成四質(zhì)粒系統(tǒng)（即第三代慢病毒系統(tǒng)），共同轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞等即可以包裝慢病毒。

慢病毒包裝過程（僅供參考）

還需準(zhǔn)備的其他實(shí)驗(yàn)材料

1．被包裝的慢病毒載體質(zhì)粒：在慢病毒包裝前，需要先獲得含有目的序列的慢病毒載體，以無(wú)內(nèi)毒素高純度的試劑盒提取慢病毒載體質(zhì)粒，并將質(zhì)粒DNA溶于無(wú)菌的TE或ddH2O中，測(cè)定其濃度及純度，保證質(zhì)粒DNA A260/A280在1.8-2.0之間。

2．慢病毒包裝用293T細(xì)胞株：良好的細(xì)胞狀態(tài)對(duì)病毒的包裝至關(guān)重要，避免細(xì)胞培養(yǎng)基有細(xì)菌、真菌或支原體的污染，盡量使用傳代次數(shù)較少的細(xì)胞，如果細(xì)胞是剛復(fù)蘇的話，傳兩代之后再包裝。

3．細(xì)胞培養(yǎng)基，血清和雙抗等

4．質(zhì)粒轉(zhuǎn)染試劑

5．其他常用實(shí)驗(yàn)耗材（如10 cm培養(yǎng)皿，離心管等）

操作步驟（以10 cm培養(yǎng)皿，為例）：

1．293T細(xì)胞分盤：轉(zhuǎn)染前一天，將293T細(xì)胞以合適的比例傳代到10 cm培養(yǎng)皿中，當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)到70%-90%時(shí)準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染。

注：細(xì)胞要充分消化，成團(tuán)細(xì)胞影響轉(zhuǎn)染效率。

2．轉(zhuǎn)染前換液：轉(zhuǎn)染前將293T細(xì)胞換成新鮮培養(yǎng)基，10 mL/10 cm皿。現(xiàn)在的轉(zhuǎn)染試劑例如Lipofectamine 2000、Lipofectamine 3000、LipoSuper（江苑生物 JY03051）和其他轉(zhuǎn)染試劑，多不受血清和抗生素的影響，此處可換為含有血清和抗生素的完全培養(yǎng)基。具體需根據(jù)轉(zhuǎn)染試劑的要求換液。

注：293T細(xì)胞貼壁性不是很好，換液時(shí)應(yīng)小心滴加盡量避免沖起細(xì)胞。

3．轉(zhuǎn)染：

★ 以使用LipoSuper（江苑生物 JY03051）轉(zhuǎn)染試劑為例：

取一只無(wú)菌的離心管，加入750 μL DMEM（不含血清和抗生素），10 μg表達(dá)目的序列的慢病毒載體質(zhì)粒（自行提供），和6.5 μg pMDLg/pRRE、2.5 μg pRSV-Rev、3.5 μg pMD2.G，用槍輕輕吹打混勻；再加入36 μL LipoSuper，用槍輕輕吹打混勻，靜置5 min，請(qǐng)?zhí)貏e注意不可Vortex或離心。將混合液均勻滴加到提前換液的細(xì)胞培養(yǎng)基中，輕輕晃勻，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，后續(xù)無(wú)需在數(shù)小時(shí)后更換培養(yǎng)液。

注：上述混合液室溫存放6 h內(nèi)穩(wěn)定。某些細(xì)胞對(duì)轉(zhuǎn)染試劑比較敏感，可以在轉(zhuǎn)染后8-12小時(shí)更換細(xì)胞培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)染效率無(wú)顯著影響。

★ 以使用Lipofectamine 3000（Invitrogen L3000015）轉(zhuǎn)染試劑為例：

取兩只無(wú)菌的離心管，一只加入500 μL Opti-MEM和36 μL Lipofectamine 3000，用槍輕輕吹打混勻；另一只加入500 μL Opti-MEM 和10 μg表達(dá)目的序列的慢病毒載體質(zhì)粒（自行提供）、6.5 μg pMDLg/pRRE、2.5 μg pRSV-Rev、3.5 μg pMD2.G，及45 μL P3000試劑，用槍輕輕吹打混勻。將兩管液體混合，再次用槍輕輕吹打混勻，不可Vortex或離心，室溫孵育10-15 min。將混合液均勻滴加到提前換液的細(xì)胞培養(yǎng)基中，輕輕晃勻，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，后續(xù)無(wú)需在數(shù)小時(shí)后更換培養(yǎng)液。

注：某些細(xì)胞對(duì)轉(zhuǎn)染試劑比較敏感，可以在轉(zhuǎn)染后8-12小時(shí)更換細(xì)胞培養(yǎng)液。Invitrogen的Protocol顯示10 cm培養(yǎng)皿Lipofectamine 3000推薦使用21.7 μL或者43.4 μL兩種劑量，自行探索哪個(gè)劑量更為合適。本實(shí)驗(yàn)室在檢測(cè)該包裝質(zhì)粒時(shí)，選用的劑量為36 μL。

4．病毒收集：轉(zhuǎn)染36 h左右后，吸取上清至新的離心管中，4℃保存。另外添加10 mL新鮮的完全培養(yǎng)基到細(xì)胞中，注意不要沖起細(xì)胞。再次大約36 h后，收取上清至同一個(gè)離心管中。

5．將兩次收集的病毒上清用0.45 μm濾器過濾后轉(zhuǎn)移到新的離心管中（若沒有0.45 μm濾器，直接將病毒上清3000 rpm，4 ℃離心5 min，棄沉淀亦可）。此時(shí)上清液中的病毒顆粒可以直接檢測(cè)滴度或者感染目的細(xì)胞，如果對(duì)病毒的滴度及純度有較高要求，可對(duì)上清液進(jìn)行濃縮與純化。

注：如果使用濾器過濾，只能使用低蛋白結(jié)合力的纖維素醋酸酯或聚醚砜（PES）膜，不能用硝酸纖維素膜（NC）。若上清較多，可以1500 rpm離心5 min，將細(xì)胞及碎片離心到管底，再進(jìn)行過濾，防止堵塞濾器。過濾時(shí)，將注射器與濾器卡緊，輕柔推動(dòng)活塞，防止用力過度造成濾器崩離注射器，使得病毒液四濺。

6．（可選）慢病毒濃縮：可以使用江苑生物的慢病毒濃縮試劑盒（JY03011）進(jìn)行慢病毒濃縮與純化，效率更高。同時(shí)，也可以自行配制PEG-8000慢病毒濃縮液濃縮慢病毒。

注：慢病毒滴度測(cè)定方法參考（江苑生物→新聞中心）

7．病毒分裝與保存：將病毒上清或濃縮后的病毒分裝，保存于-80℃。

注：病毒液一定要分裝，切忌反復(fù)凍融，凍融一次病毒滴度將降低20-60%。

包裝效率低可能存在的問題：

1．優(yōu)化質(zhì)粒與轉(zhuǎn)染試劑比例，對(duì)于難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，可適當(dāng)增加轉(zhuǎn)染試劑的用量。

2．應(yīng)使用高純度、無(wú)內(nèi)毒素、無(wú)污染物的質(zhì)粒進(jìn)行包裝，DNA純度方面A260/A280比值要接近1.8，通常宜控制在1.8-1.9范圍內(nèi)，偏低則有可能有蛋白污染，偏高則有可能有RNA污染。

3．包裝細(xì)胞（例如293T）狀態(tài)對(duì)病毒的包裝很重要，盡量使用傳代次數(shù)較少的細(xì)胞。狀態(tài)不好的293T可能導(dǎo)致包裝效率降低60%以上。輕柔換液就能導(dǎo)致半數(shù)細(xì)胞漂起，這樣的293T細(xì)胞包裝效率極低。請(qǐng)從正規(guī)細(xì)胞庫(kù)購(gòu)買細(xì)胞，借來或者不正規(guī)公司獲得的細(xì)胞可能會(huì)因?yàn)閭鞔螖?shù)過多影響包裝效率。避免細(xì)胞培養(yǎng)基有細(xì)菌、真菌或支原體的污染。

4．表達(dá)目的序列的載體質(zhì)粒過大，會(huì)降低包裝效率。載體質(zhì)粒容納外源基因長(zhǎng)度的能力是有限的，盡管理論上，在LTR之間可以插入的基因長(zhǎng)度約為8.5 kb，但超過3 kb就會(huì)導(dǎo)致包裝效率降低。而整個(gè)載體質(zhì)粒過大，也會(huì)導(dǎo)致包裝效率降低，進(jìn)而影響病毒滴度。若不能控制插入片段的大小，需盡量選擇較小的載體骨架。

5．CRISPR-Cas9質(zhì)粒中，Cas9基因長(zhǎng)度就達(dá)4 kb左右，整個(gè)載體質(zhì)粒15 kb左右，故其慢病毒包裝效率和感染能力比一般病毒低，包裝時(shí)產(chǎn)生的空殼病毒（即有病毒外殼，但沒有組裝進(jìn)目的基因的病毒）比較多。感染細(xì)胞時(shí)，空殼病毒會(huì)競(jìng)爭(zhēng)細(xì)胞表面受體，造成正確感染率下降，因此密度梯度離心、PEG純化法和超濾法等濃縮病毒再感染目的細(xì)胞可提高病毒感染效果。

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