呋喃妥因酶聯免疫試劑盒說明書

1概要

硝基呋喃類（Nitrofurans）化合物是一類合成的廣譜性KJ劑，因價格低廉LX佳，被廣泛應用于畜牧、水產養殖中，但由于硝基呋喃類KJ劑及其代謝物在動物源性食品中的殘留可以通過食物鏈傳給人類，長期攝入會引起各種疾病，對人體有致癌、致畸胎等副作用。1995年起歐盟禁止硝基呋喃類KJ劑在畜禽及水產動物食品中使用，并嚴格執行對可食用動物組織中硝基呋喃的殘留檢測，2002年美國亦隨之制定相應法規。我國農業部2002年第193號公告《食品動物禁用的獸藥及其它化合物清單》中將硝基呋喃類列為禁用藥。

常用的硝基呋喃類KJ劑包括：呋喃唑酮、呋喃它酮、呋喃西林與呋喃妥因，代謝物分別為：AOZ（3-amino-2-oxazolidinone）、AMOZ（3-amino-5-morpholino-methyl-2-oxazolidinone）、SEM（semicarbazide）、AHD（1-aminohydantoin）。硝基呋喃類KJ劑在生物體內很快被代謝，代謝物與蛋白質結合后能穩定存留一段時間，所以檢測硝基呋喃類殘留時通常是檢測其代謝物。

目前普遍利用LC-UV、LC-MS、LC-MS/MS進行AHD的殘留檢測，相對于高成本的儀器分析，酶聯免疫分析法（ELISA）可提供經濟、簡單、低成本且大量初篩的檢測。本公司研發的AHD酶聯免疫快速檢測試劑盒，經衍生，萃取，ELISA分析即可完成檢測。本試劑盒可用于定性、定量檢測水產中AHD的殘留。

2原理

本試劑盒采用直接競爭ELISA法檢測樣品中的AHD殘留。在微孔板上預包被抗AHD抗體，樣品或標準溶液中的AHD和HRP標記的AHD競爭結合微孔板中抗AHD抗體，洗滌后用H2O2-TMB底物系統顯色，樣品吸光度值與其所含AHD量成負相關，與標準曲線比較即可得出AHD含量。

3試劑盒組份

每個試劑盒中的試劑可進行96個測量（包括標準測定），試劑盒組份：

包被有AHD抗體微孔板----------------------96孔（8孔/條×12條）

AHD標準品溶液-------------------------------------------6瓶（1mL/瓶）0號：0μg/L；1號：0.01μg/L；2號：0.03μg/L；3號：0.09μg/L；4號：0.27μg/L；5號：0.81μg/L

AHD標記HRP溶液--------------------------------------------1瓶（7mL）

底物溶液A-------------------------------------------------------1瓶（7mL）

底物溶液B--------------------------------------------------------1瓶（7mL）

終止液-------------------------------------------------------------1瓶（7mL）

10×濃縮洗滌/復溶液----------------------------------------1瓶（30mL）

10×濃縮提取劑------------------------------------------------1瓶（40mL）

衍生化試劑------------------------------------------------------1瓶（10mL）

封板膜------------------------------------------------------------------------1張

說明書------------------------------------------------------------------------1份

4另外所需儀器和試劑

4.1試劑

1MNaOH溶液：準確稱取4gNaOH（分析純）,加入蒸餾水（或去離子水）定容至100mL。注明配制日期，室溫放置，有效期為1個月。

1MHCl溶液：準確吸取1體積含量為36.5%的分析純HCl，加入11體積蒸餾水（或去離子水），混合均勻。注明配制日期，室溫放置，有效期為1個月。

乙酸乙酯（分析純）

正己烷（分析純）

4.2儀器

微孔板酶標儀（450nm）

恒溫箱（37℃）

天平（精度0.01g）

均質機

振蕩器

離心機和離心管

水浴鍋

旋轉蒸發器或氮吹儀

可調式0.5μL～20μL，20μL～200μL和100μL～1000μL微量移液器

多道移液器

5樣品處理

5.1魚、蝦樣本（稀釋倍數為4倍）

配制1×洗滌/復溶液：將10×濃縮洗滌/復溶液和蒸餾水（或去離子水）按1:9充分混勻，臨用前配制。

配制1×提取劑：將10×濃縮提取劑和蒸餾水（或去離子水）按1:9充分混勻，臨用前配制。

取勻質的樣品1.0g（組織肉類應確保樣本無明顯的塊狀的組織，提取前，樣本保存于-20℃）于50mL離心管中，加入4mL蒸餾水或去離子水，0.5mL1MHCl，100μL衍生化試劑，最大速度渦旋混勻5分鐘（確保樣本沒有結塊）。

60℃水浴3小時，保證樣本在60℃環境下衍生化3小時或者37℃過夜（16h）。

加入5mL1×提取劑，0.4mL1MNaOH，5mL乙酸乙酯，渦旋混勻2min。

室溫（20-25℃）下4000rpm離心10分鐘，取上清液2.5mL于另一只10mL離心管中。

60℃水浴環境下，氮吹去除有機溶劑（氮吹時，使用流量為6L/min，一般吹20分鐘即可）。

加入2mL正己烷，渦旋1分鐘。加入2mL1×洗滌/復溶液渦旋1分鐘，室溫下4000rpm離心10分鐘。棄上層有機相，取下清液100μL用于測定。

6注意事項

乙酸乙酯層一般20分鐘即可吹干，若仍然有有機溶劑殘存，應適當延長氮吹時間，盡量去除有機溶劑。

由于正己烷對有機類容器，如塑料離心管，有侵蝕作用，吹干乙酸乙酯層步驟應盡量使用玻璃試管，或一次性聚苯乙烯或聚丙烯試管，以免侵蝕作用產生的雜質影響實驗結果。

由于槍頭和乙酸乙酯有一定的浸潤作用，使得實際吸取量大于要求量，可能會造成添加回收實驗的回收率稍有偏高的現象。因此在吸取時注意吸取量要控制準確。

盡量避免正己烷摻入到ELISA的測定中。建議采用如下辦法：吸取掉正己烷相后，穿過液體表面，吸取350μL下層水相于干凈的小管中，室溫避光靜置30分鐘，再從該小管中直接吸取100μL用于檢測，不必吹打。

標準品中含有高濃度的AHD，請小心使用，避免污染試劑盒以及檢測樣本。

嚴格按照說明書的相應說明來保存和使用試劑盒內的各種試劑。

ELISA盡量保持在室溫環境下操作，以避免因溫度差異帶來的變異；同時避免在通風口和陽光直射下操作。

試劑盒試劑稀釋以及樣本提取確保使用蒸餾水或去離子水；有機溶劑在有效期內使用，各項指標應符合分析純標示。

確保樣本正確儲存(測試樣本在~8℃下冷藏盡量不超過1天，其余分裝-20℃凍存)。

試劑使用之前應充分混勻，以保證試劑的使用濃度合理。

不要使用過期的試劑盒。

不同批次的酶標抗原和抗體微孔板不能混用。

試劑盒保存于2～8°C，不能冷凍，未用的微孔板放回原鋁箔袋密封后2-8°C存放，底物溶液要避光保存。

使用之前，將樣本及所需試劑的溫度平衡至20～25°C，否則可能導致后面檢測吸光值偏低。試劑使用完后應立即放回2～8°C冷藏。

洗板后出現板孔干燥，會導致標準曲線線性不好，因此洗板拍干后應立即進行下一步操作。

反應終止液為2M硫酸，應避免與皮膚和衣物接觸。

底物溶液如果變藍表示已經變質，不能使用。

零標準品的吸光值＜0.6時，表示試劑盒已經變質，不能使用。

7檢測步驟

編號：將AHD標準品和待測樣品對應微孔按序編號，建議每個標準品和待測樣品均做重復孔。

加樣：每孔加入AHD標品或樣品100μL，然后加入AHD標記HRP溶液50μL。

溫育：輕輕振蕩混勻，用封板膜封板后在37℃恒溫箱中靜置30分鐘。

洗滌：小心揭開封板膜，用1×洗滌液每孔250μL洗滌微孔板，連續洗滌3次，用吸水紙拍干。

顯色：將底物溶液A與底物溶液B等體積混合，每孔加入此顯色液100μL，37°C環境避光顯色15分鐘。

測定：每孔加入終止液50μL，輕輕振蕩混勻，加入終止液后5分鐘內測定450nm處吸光度值。

8結果判定

8.1計算B/B0

所獲得的標準品溶液或待測樣品的吸光值（B）除以0號標準品溶液的吸光值（B0）再乘以100%，即為百分吸光值。

百分吸光值（%）=B/B0*100%

公式中：

B標準品溶液或待測樣品的吸光值

B00號標準品溶液的吸光值

8.2繪制標準曲線，計算樣品中AHD濃度

以AHD標準溶液濃度為X軸，對應的百分吸光度值為Y軸，在半對數坐標紙上繪制標準曲線。相對應每一個樣品的濃度可以從標準曲線上讀出。也可以用回歸方程法，計算出樣品中AHD的濃度。

AHD實際含量(μg/kg)＝C×D

公式中：

C：稀釋后樣品提取液中AHD含量（μg/L）

D：樣品稀釋倍數

注：為獲得樣品中AHD的實際含量（μg/kg），從標準曲線上讀出的濃度值應當乘以相應的稀釋倍數。

9檢測限、準確度、精密度、特異性

試劑盒靈敏度：0.05μg/L

zuidi檢測限：

回收率（準確度）：

精密度：試劑盒變異系數小于15%

特異性：

10儲存條件

于2~8°C貯存。

11有效期

未開封試劑盒有效期為12個月，開封后3個月內用完。（見包裝盒上標簽有效期）