產(chǎn)品描述

淋巴細(xì)胞分離液（Lymphocyte Separation Medium 1.084，簡(jiǎn)稱LSM-1.084）是一種無(wú)菌的即用型分離液，基于Böyum的Ficoll-甲泛影鈉溶液做過(guò)一些改良，使得操作簡(jiǎn)單快速且分離效率更高。本品是無(wú)菌的聚蔗糖Ficoll/泛影酸鈉混合溶液，密度為1.084 g/ml，內(nèi)毒素含量很低（＜0.12 EU/mL），是在嚴(yán)格控制的環(huán)境下加工生產(chǎn)的，生產(chǎn)條件符合ISO13485:2003標(biāo)準(zhǔn)和GMP認(rèn)證。相對(duì)于密度為1.077 g/mL的人淋巴細(xì)胞分離液，本品適用于分離更高密度的人單個(gè)核細(xì)胞，包括外周血，臍帶血以及骨髓瘤來(lái)源的組織樣本。還適用于分離大小鼠血細(xì)胞，正因?yàn)閲X動(dòng)物的淋巴細(xì)胞密度稍高于人淋巴細(xì)胞。

 

工作原理

去纖維蛋白或抗凝人血以1：1的比例用無(wú)菌生理鹽水或平衡鹽溶液稀釋，小心的添加在分離液上層（不要混雜在一起），之后離心30-40 min。離心過(guò)程中，差速遷移使其最終形成幾個(gè)不同的細(xì)胞分層：

① 聚集在管底的顆粒主要是Ficoll 聚集的紅細(xì)胞以及沉淀物；

② 緊挨著上面一層的顆粒主要是粒細(xì)胞，其處于LSM-1.084溶液的滲透壓臨界，具有足夠高的密度遷移穿過(guò)LSM-1.084溶液層。

③ 單個(gè)核細(xì)胞分布在血漿和LSM-1.084分離液的中間層，還包括一些沉降系數(shù)低（密度低）的顆粒，如血小板。

淋巴細(xì)胞，單核細(xì)胞和血小板不具有足夠高的密度穿透LSM-1.084分離液層，因此這些細(xì)胞在血漿和LSM-1.084分離液層聚集形成一個(gè)中間分層。吸取中間層，用平衡鹽溶液短暫洗滌，以除去血小板，細(xì)胞分離介質(zhì)和血漿，就可以分離單個(gè)核細(xì)胞。通常情況下，分離所得的細(xì)胞中95±5%為單個(gè)核細(xì)胞，細(xì)胞存活率＞90%，回收率為60±20%。

 

運(yùn)輸與保存方法

室溫運(yùn)輸。4-30 °C密閉避光環(huán)境下可穩(wěn)定保存3年，開(kāi)瓶后需4-8 °C保存。

 

影響單個(gè)核細(xì)胞分離效果的因素

1. 血液樣品保存時(shí)間

血液盡可能新鮮且無(wú)血塊，為獲得最佳分離效果，最好在取血2h內(nèi)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。血液放置過(guò)久可能會(huì)降低細(xì)胞存活率、回收率，甚至有可能引入粒細(xì)胞和紅細(xì)胞污染，放置超過(guò)6h可能會(huì)嚴(yán)重影響分離效果。

2. 血液體積

血液量和管徑?jīng)Q定樣本在管子中的高度，以及后續(xù)的離心時(shí)間。提高離心管內(nèi)的血液高度會(huì)引入紅細(xì)胞污染的可能。但是分離效率不會(huì)明顯受管徑的影響。因此，對(duì)于體積大的血樣，建議可在保持離心時(shí)間不變的情況下選擇更大直徑的離心管。

3. 紅細(xì)胞去除

單個(gè)核細(xì)胞分離的產(chǎn)量和純度與紅細(xì)胞是否去除干凈有關(guān)。

若全血中紅細(xì)胞發(fā)生凝集會(huì)導(dǎo)致一些單個(gè)核細(xì)胞也被聚集在內(nèi)，從而在離心后被沉降在紅細(xì)胞層內(nèi)。可通過(guò)稀釋全血的方法來(lái)避免此現(xiàn)象。溫度大小會(huì)影響紅細(xì)胞的凝集，18℃條件能提供最佳的分離效果。若溫度升高（如37℃）會(huì)提高紅細(xì)胞凝集的可能，降低分離效果。低溫（4℃）環(huán)境紅細(xì)胞聚集可能降低，需要增加離心時(shí)間。提高離心時(shí)間到5-10 min能減低紅細(xì)胞污染。

4. 血小板污染

對(duì)于血小板要求較為嚴(yán)格的分離實(shí)驗(yàn)，使用4-20%的蔗糖梯度層加在LSM-1.084溶液層上方，再次離心以去除所有的血小板。離心后，血小板分布在蔗糖溶液上方，單個(gè)核細(xì)胞穿過(guò)蔗糖溶液停留在LSM-1.084溶液上方。

 

操作方法

1. 材料準(zhǔn)備

1）樣本體積（4 mL總體積）：取2 mL的去纖維蛋白或抗凝血，將其與等體積（2 mL）的無(wú)菌鹽溶液以1：1比例混合。注：大體積的血樣可以得到相同的分離效率，只需要選用更大直徑的離心管，以維持血樣的高度（約3 cm）和LSM-1.084溶液的高度（約2.4 cm）。

2）LSM-1.084分離液，使用前需放到室溫環(huán)境下溫度平衡10-30 min；

3）平衡鹽溶液：用做稀釋和清洗液，建議直接購(gòu)買商業(yè)化的鹽溶液。也可以使用其他溶液，如不含Ca²⁺/Mg²⁺的磷酸鹽溶液（如DPBS溶液），Hank’s，或者細(xì)胞培養(yǎng)液（如RPMI 1640）。

2. 分離單個(gè)核細(xì)胞

1）取2 mL的去纖維蛋白或抗凝血，將其與等體積（2 mL）的無(wú)菌鹽溶液以1：1比例混合，于10-15 mL離心管中顛倒混勻，或用槍上下輕輕吹打數(shù)次以至混勻。

注：肝素、EDTA、檸檬酸鈉、ACD、CPD抗凝皆可。去纖維蛋白血不需要抗凝劑。

2）使用前輕輕顛倒瓶子使LSM-1.084充分混合，用注射器或槍頭無(wú)菌條件轉(zhuǎn)移3 mL LSM到10-15 mL離心管中。

3）小心將稀釋血液加入3 mL LSM-1.084（室溫即可）的上層，使得在血液和LSM間形成一個(gè)明顯的分層。不要將稀釋血液混入LSM-1.084中，如圖1。

 

圖1. 加樣后分層示意圖

4）室溫下400×g離心30-40 min，離心可以沉淀紅細(xì)胞和多形核白細(xì)胞，同時(shí)可以在LSM-1.084上形成一層單核-淋巴細(xì)胞分層，如圖2所示（從上到下，依次分為血漿層-單個(gè)核細(xì)胞層-LSM-1.084層-粒細(xì)胞-紅細(xì)胞）。

5）用無(wú)菌槍頭吸掉單個(gè)核細(xì)胞層（含淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞）上方2-3 mm的血小板/血漿，小心操作勿吸入單個(gè)核細(xì)胞層內(nèi)破壞其平衡（如圖2）。

注：也可以不用先吸走血漿層，直接用槍吸取單個(gè)核細(xì)胞層。另外，上層血漿不含細(xì)胞，也可以留作他用。
 

                     

圖2.吸除上層血漿和血小板前后分層示意圖

 

6）用無(wú)菌槍頭將單核細(xì)胞層轉(zhuǎn)移入一個(gè)新的無(wú)菌離心管。

注：一定要吸取所有的單個(gè)核細(xì)胞中間層，以及少量上方的血漿液和下方的LSM-1.084分離液。

7）預(yù)估轉(zhuǎn)移后的單個(gè)核細(xì)胞量，加入至少3倍體積（約6 mL）的平衡鹽溶液于上述離心管中。

8）使用槍頭上下輕輕吹打?qū)螌蛹?xì)胞溶液充分懸浮。

9）室溫400-500×g離心10-15 min。

注：高速離心有助于提高單個(gè)核細(xì)胞的回收率，但如果需要徹底去除血小板，則推薦低速離心（60-100×g）。

10）去除上清，加入6-8 mL平衡鹽溶液重懸單核細(xì)胞。

11）室溫400-500×g（或者60-100×g去除血小板）離心10 min。

12）去除上清，用適當(dāng)培養(yǎng)基重懸單個(gè)核細(xì)胞備用。

3. 分離粒細(xì)胞

1）-6）同上方單個(gè)核細(xì)胞的分離步驟。

7）小心吸除LSM-1.084層，注意切勿吸入粒細(xì)胞層。

8）轉(zhuǎn)移暴露在表面的白色粒細(xì)胞層（位于紅細(xì)胞層上方）于一個(gè)無(wú)菌的50mL離心管。

9）加入至少5倍體積的平衡鹽溶液重懸粒細(xì)胞，于400×g離心15 min。

10）吸除上清，加入6-8 mL平衡鹽緩溶液重懸粒細(xì)胞，于室溫400-500×g離心10 min。

11）吸除上清，用適當(dāng)培養(yǎng)液重懸粒細(xì)胞備用。

 

注意事項(xiàng)

1）稀釋去纖維蛋白血液或肝素化血液用的鹽溶液為無(wú)菌液體。

2）為保持淋巴細(xì)胞的活性，應(yīng)該采血后盡快進(jìn)行分離。分離細(xì)胞層實(shí)際上是單個(gè)核細(xì)胞層，包括淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞。

3）為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作；

4）本產(chǎn)品僅作科研用途！

 

HB211105