酶切點位

5'-A↓AGCTT-3'

3'-TTCGA↑A-5'

 

產品描述

FuniCut™系列內切酶是通過基因工程重組技術，可在5~15 min內精確完成DNA切割的快速限制性內切酶，適用于快速切割質粒DNA、PCR產物、基因組DNA等。FuniCut™系列快速內切酶共用一種酶切緩沖液，從而簡化了酶切反應體系，另外，有良好的酶活冗余度，可輕松處理底物過量或困難模板的酶切。

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產品組分

組分編號	組分名稱	產品規格
15012-A	FuniCut™ HindIII	500 μL
15012-B	10×FuniCut™ Buffer	3×1 mL
15012-C	10×FuniCut™ Color Buffer	3×1 mL

 

運輸與保存方法

冰袋運輸。-20°C保存，有效期2年。

 

識別位置

5'-A↓AGCTT-3'

3'-TTCGA↑A-5'

 

推薦反應條件

1× FuniCut™ 緩沖液；

最適37°C孵育。

 

失活條件

80°C孵育20 min。

 

注意事項

1）3 h孵育未表現星號活性，延時酶切可能出現星號活性；

2）受EcoBI甲基化影響，序列可能重疊，剪切受阻；

3）為了您的安全和健康，請穿實驗服并佩戴一次性手套操作；

4）本產品僅作科研用途！

 

質量控制

1. 功能活性檢測：最適反應溫度下，在20 μL反應體系中，1 μL酶能夠在15 min內完全消化1 μg λDNA。

2. 超長時間孵育檢測：最適反應溫度下，將1 μL酶與1 μg λDNA共孵育3 h，未檢測到其他核酸酶污染或星號活性引起的底物非特異性降解，但延長孵育時間可能出現星號活性。

3. 酶切-連接-再酶切檢測：最適反應溫度下，使用1 μL酶消化底物，回收酶切產物，在22°C下使用適量T4 DNA連接酶可以將酶切產物重新連接，將連接產物再次回收后，使用相同的內切酶可以重新切開連接產物。

4. 非特異性內切酶活性檢測：最適反應溫度下，將1 μL酶與1 μg超螺旋質粒DNA共同孵育4 h后，使用瓊脂糖凝膠電泳檢測，質粒DNA仍然處于超螺旋狀態。

5. 藍白斑檢測：將含有單一lacZα基因的載體以1 μL酶消化，重新連接后轉化入大腸桿菌感受態細胞，涂布在含有對應抗生素、IPTG和X-gal的LB培養基平板上。連接正確的產物會生長出藍色菌落，而連接錯誤（即DNA末端切口不完整）的產物將得到白色菌落。對于FuniCut™系列限制酶而言，白色菌落比例應小于1%。

 

使用方法

1. DNA快速酶切流程

1）按如下建議的加樣順序配制體系反應液（冰上操作）：

組分	質粒DNA	PCR產物	基因組DNA
ddH2O	15 μL	16 μL	30 μL
10×FuniCut™ Buffer或10×FuniCut™ Color Buffer	2 μL	3 μL*	5 μL
底物DNA	2 μL（~1 μg）	10 μL (~0.2 μg)	10 μL (5 μg)
FuniCut™ HindIII	1 μL	1 μL	5 μL
Total	20 μL	30 μL	50 μL

*本體系指已純化后的PCR產物。未純化的PCR產物具備一定的離子強度，10×FuniCut ^TM Buffer加入量可適當減少至2 μL。若下一步進行克隆等實驗，酶切前需純化PCR產物。

2）輕柔吸打或輕彈管壁以混勻（切勿渦旋），然后瞬時離心以收集掛壁液滴。

3）37°C孵育15 min（質粒），或15~30 min（PCR 產物），或30~60 min（基因組 DNA）。

4）80°C孵育20 min即可使酶失活，停止反應（可選）。

2. 雙酶切或多酶切

1）每種內切酶的用量為1 μL，并根據需要適當擴大反應體系。

2）所有內切酶的體積總和不得超過總反應體系的1/10。

3）如果選用的幾種內切酶的最適反應溫度不同，應先以最適溫度低的酶開始酶切，再添加最適溫度較高的酶，以較高的溫度進行孵育。

3.質粒的擴大反應體系

組分	體積（20 μL）	體積（20 μL）	體積（50 μL）
DNA	1 μg	2 μg	5 μg
FuniCut™ HindIII	1 μL	2 μL	5 μL
10×FuniCut™ Buffer或10×FuniCut™ Color Buffer	2 μL	2 μL	5 μL
Total	20 μL	20 μL	50 μL

【注】：如果總反應體系大于20 μL，可使用水浴、金屬浴或沙浴，并增加孵育時間。

 

不同DNA中的識別位點數

λDNA	ΦX174	pBR322	pUC57	pUC18/19	SV40	M13mp18/19	Adeno2
6	0	1	1	1	6	1	12

 

甲基化修飾影響

Dam	Dcm	CpG	EcoKI	EcoBI
無影響	無影響	無影響	無影響	序列可能重疊 剪切受阻

 

不同反應緩沖液中的活性

反應緩沖液	FuniCut™ Buffer	Thermo Scientific FastDigest Buffer	NEB CutSmart® Buffer	Takara QuickCut™ Buffer
活性	100%	75%	100%	100%

【注】：活性數據來自翌圣生物限制酶標準反應體系下的檢測。

 

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產品名稱	貨號	規格
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