產品描述

螢火蟲螢光素酶（Firefly luciferase）是一種分子量約為61 kDa的蛋白，在ATP、鎂離子和氧氣存在的條件下，能夠催化螢光素（luciferin）氧化成oxyluciferin，在luciferin氧化的過程中會發出波長為560 nm左右的生物熒光，該螢光可通過化學發光儀進行測定。檢測原理如圖所示：

圖1：螢火蟲螢光素酶檢測原理圖

Luciferase Reporter Gene Assay kit是一閃光型螢火蟲螢光素酶報告基因檢測試劑盒，具有靈敏度高的特點，可以高靈敏的檢測螢光素酶在哺乳動物細胞中的表達。

 

產品組分

組分編號	組分名稱	產品編號/規格
		11401ES60（100 T）	11401ES76（500 T）	11401ES80（1000 T）
11401-A	細胞裂解液	20 mL	5×20 mL	10×20 mL
11401-B	螢火蟲螢光素酶檢測試劑	10 mL	5×10 mL	10×10 mL

 

運輸和保存方式

干冰運輸。-20℃保存，有效期1年。

試劑盒內螢火蟲螢光素酶檢測試劑不能反復凍融，建議分裝-20℃或-80℃保存。

 

注意事項

1）檢測過程中需自備耗材和設備包括如下：PBS；100 μL移液器或者排槍；不透光白色酶標板；Luminometer發光計、多功能酶標儀或者其他能夠檢測生物發光的儀器；

2）反應溫度：酶促反應對溫度較為敏感，加樣檢測前務必將所有試劑平衡至室溫（20-25℃）再使用；

3）檢測儀器：能檢測化學發光的儀器都適用，但由于不同儀器的設置和靈敏度不同，測得的光信號值也會不同；

4）檢測設置：Luminescence，350-700 nm，建議檢測時間設為2-10 sec；

5）檢測板：為防止孔間干擾，推薦使用不透光白色酶標板。黑色酶標板也可用，但因黑色會吸收光信號，可能會降低信號；

6）單管熒光測定儀測定，每個樣品與測定試劑混合后到測定前的時間應保持一致；

7）為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套；

8）本產品僅作科研用途！

 

實驗步驟

I.前處理

1.細胞

1）構建相應的載體。

2）轉染步驟請參照相關的說明書。

3）將細胞裂解液充分混勻，按如下方式加入細胞裂解液，充分裂解細胞。

a: 對于貼壁細胞，吸盡細胞培養液，按照下表比例加入細胞裂解液，輕輕旋轉培養皿或者培養板使裂解液完全覆蓋細胞；

b: 對于懸浮細胞，離心棄去上清，按照下表比例加入裂解液。

細胞培養板	96孔板	48孔板	24孔板	12孔板	6孔板
裂解液加入量	100 μL	150 μL	200 μL	300 μL	500 μL

冰上孵育5 min，充分裂解細胞。

【注】：裂解產物可室溫保存6 h；4℃保存16 h；-80℃可長期存放（裂解產物不能多次反復凍融），本試劑盒裂解液數量按照24孔板添加量進行配制，如需要更多可單獨購買（CAT#11406）。

5）（選作）10000-16000 rpm離心1 min，取上清。

2.葉片組織（以煙草葉片為例，僅供參考）

1）構建相應的載體。

2）挑取轉化有重組質粒的農桿菌單菌落，接種到2 mL LB液體培養基（添加相應抗生素）中，28℃ 220 rpm培養過夜。

3）農桿菌培養至OD600為1.0，1700× g離心5 min收集菌體后，用1/2MS液體培養基清洗菌體2次；用含有150 μmol/L乙酰丁香酮的1/2MS液體培養基將農桿菌的OD600調至1.0。

4）將待檢測的農桿菌菌液進行混合，使每種菌液的OD600為0.5。

5）選取生長期為1個月左右完全伸展的煙草葉片，將混合好的菌液用1 mL注射器(去掉針頭)從煙草葉背面進行注射。為保證實驗結果的一致性，需要將對照載體和待檢測目標載體的菌液注射在同一葉片的不同部位上, 以保證相同的生長背景。

6）正常溫室生長條件下，24-48 h即可取樣觀察。

7）取3-4片直徑為6-8 mm的葉盤，放入2 mL的 EP 管（提前放入3-4個小鋼珠）中，液氮中冷凍，使用破碎儀進行研磨破碎（45 Hz，30 s）。破碎完全后在EP管中加入100 μL裂解液。

8）冰上孵育5 min左右，充分裂解葉片。

9）10000-16000 rpm離心1 min，取上清。

3.原生質體（僅供參考）

構建相應的載體。

制備原生質體（參考相關文獻：Yoo SD, Cho YH, Sheen J (2007). Arabidopsis mesophyll protoplasts: a versatile cell system for transient gene expression analysis. Nat Protoc 2, 1565–1572）。

在2 mL EP管中加入相應的載體（加入量需要摸索），加入100 μL原生質體懸浮液。輕搖混勻后，加入110 μL PEG-CaCl2溶液，輕彈混勻。在室溫放置10-15 min。

4）加入440 μL W5溶液，上下顛倒以停止轉化。

5）200× g 室溫離心5 min，棄去上清，加入800 μL WI溶液重懸原生質體。

室溫避光培養16-24 h。

7）將原生質體加入2 mL離心管中，離心收集原生質體，加入100 μL左右的裂解液。

8）冰上孵育5 min左右，充分裂解原生質體。

9）（選做）10000-16000 rpm離心1 min，取上清。

 

II.熒光檢測

1）按照儀器說明書要求將熒光測定儀打開，設定參數，測定時間為10 sec，測定間隔為2 sec。

2）取20 μL裂解液加入測量管中（保持每次樣品的加樣量一致），另外加入100 μL螢火蟲螢光素酶檢測試劑，震板混勻

2-3次，充分混勻后測定RLU（Relative light unit）。

3）分析數據。

①實驗設計：根據不同實驗目的，在每個培養板中都應設置對照組、實驗組和空白對照組。為了保證實驗準確性，理論上每個實驗組（包括對照組）都應當減去空白對照組的螢火蟲螢光素酶的發光測量值。

a.空白對照組：

背景F：未轉染細胞+螢火蟲螢光素酶檢測試劑。

注：空白對照組的樣品量必須與實驗樣品量相同，包含與實驗樣品相同的培養基/血清組合，并加上完全相同的檢測試劑。

b.實驗組：轉染細胞經實驗化合物處理(即實驗組F)。

c.對照組：轉染細胞不經處理，用以標準化結果(即對照組F)。

②計算結果：

實驗組=實驗組F-背景F。

對照組=對照組F-背景F。

表達倍數=實驗組/對照組。

 

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產品名稱	貨號	規格
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 HB220325