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2025-01-10 17:03:44流式細(xì)胞分揀: 流式細(xì)胞分揀是一種先進的細(xì)胞分析技術(shù)，它結(jié)合了流式細(xì)胞術(shù)與細(xì)胞分選功能。該技術(shù)通過特定的標(biāo)記抗體對細(xì)胞進行染色，利用激光激發(fā)熒光信號，實時分析細(xì)胞的多種生物特性。基于這些分析數(shù)據(jù)，流式細(xì)胞儀能夠高速、精確地將目標(biāo)細(xì)胞從混合細(xì)胞群體中分揀出來。這一過程對于細(xì)胞生物學(xué)研究、免疫治療、干細(xì)胞療法等領(lǐng)域具有重要意義，有助于科學(xué)家和醫(yī)生深入研究細(xì)胞功能、疾病機制及潛在的治療方法。

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流式細(xì)胞分揀問答

2023-05-22 15:19:22如何通過流式細(xì)胞術(shù)鑒別細(xì)菌和病毒感染？: 抗生素的過度使用會導(dǎo)致人類細(xì)菌感染對抗生素的耐藥性增加，已成為目前全球十大公共衛(wèi)生威脅之一。根據(jù)世界衛(wèi)生組織（世衛(wèi)組織）最新報告顯示，根據(jù)87個國家在2020年報告的數(shù)據(jù)，常見細(xì)菌感染對治療的耐受性越來越強，導(dǎo)致致命血流感染的細(xì)菌耐藥性很高，并且造成社區(qū)常見感染的幾種細(xì)菌對治療的耐受性也在增加。由于臨床上很難及時有效地區(qū)分細(xì)菌和病毒感染，可能是導(dǎo)致抗生素過度使用的原因之一。目前臨床上檢測感染類型的方法有很多，以下是一些常見的方法：癥狀和體征：雖然某些癥狀和體征可能與細(xì)菌和病毒感染都有關(guān)，但一些癥狀和體征可能更常見于特定類型的感染。例如，喉嚨痛和咳嗽可能是細(xì)菌感染的跡象，而流鼻涕和打噴嚏可能是病毒感染的跡象。細(xì)菌和病毒檢測：醫(yī)生可以通過分析患者的血液、尿液或其他生物體液樣本來檢測細(xì)菌或病毒的存在。細(xì)菌感染可以通過培養(yǎng)細(xì)菌并觀察其在培養(yǎng)基上的生長來檢測，而病毒感染通常需要使用特殊的檢測方法，例如PCR（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）。白細(xì)胞計數(shù)：細(xì)菌感染通常導(dǎo)致白細(xì)胞計數(shù)升高，而病毒感染則不一定如此。C反應(yīng)蛋白（CRP）和其他生化指標(biāo)：在細(xì)菌感染中，CRP和某些細(xì)胞因子等其他生化指標(biāo)通常會升高，而在病毒感染中，它們通常會保持正常水平或輕微升高。這些方法可以幫助臨床醫(yī)生在一定程度上區(qū)分細(xì)菌感染和病毒感染，但在靈敏度、特異性、操作便捷性和報告及時性仍存在一定的挑戰(zhàn)，因此研究者們也一直在尋找更及時有效的檢測方法，這一次，研究者們把目光聚焦在對機體對感染的免疫應(yīng)答上！免疫系統(tǒng)作為機體對抗外來病原體的重要防線，會對感染做出及時響應(yīng)，通過觀察免疫細(xì)胞在感染中的免疫應(yīng)答是否也可以及時有效地區(qū)分細(xì)菌和病毒感染？先天免疫系統(tǒng)是免疫應(yīng)答的第一道防線，髓系細(xì)胞，如粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、NK細(xì)胞、DC，有助于先天免疫系統(tǒng)識別入侵的病原體和組織損傷。這些細(xì)胞在與微生物和損傷模式（PAMP、DAMP）接觸時被激活，引發(fā)強烈的炎癥反應(yīng)，并釋放各種促炎介質(zhì)，如細(xì)胞因子、干擾素（IFN）和特異性細(xì)胞標(biāo)志物。這是由先天免疫系統(tǒng)提供的對感染的即時反應(yīng)。研究表明當(dāng)機體受到細(xì)菌或病毒攻擊時，先天免疫系統(tǒng)的髓樣細(xì)胞會做出不同的反應(yīng)1。在機體受到炎癥刺激、自身免疫疾病、細(xì)菌或病毒感染后激活干擾素（I型和II型）信號傳導(dǎo)，I型和II型干擾素（IFN）是調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的核心參與者，I型IFN介導(dǎo)病毒性免疫應(yīng)答，II型IFN介導(dǎo)細(xì)菌性免疫應(yīng)答。因此，髓系細(xì)胞活化指標(biāo)是感染早期檢測的理想標(biāo)志。圖1病毒和細(xì)菌感染的特異性干擾素應(yīng)答；I型IFN（IFNα、IFNβ）：病毒感染；II型IFN（IFNγ）：細(xì)菌感染CD169、CD64和HLA-DR是中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞等髓樣細(xì)胞表達的活化標(biāo)志物，它們在感染檢測和免疫功能評估中具有重要作用。CD169，也稱為Siglec-1，是一種膜上糖蛋白，屬于蛋白質(zhì)家族Siglec。CD169主要表達在樹突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的表面，并與細(xì)胞外病毒顆粒的糖基結(jié)構(gòu)特異性結(jié)合，促進病毒的吞噬和清除。因此，CD169在感染檢測中具有重要作用。研究表明，病毒感染后，CD169的表達水平會上調(diào)，這表明CD169可能是一種早期的病毒感染指標(biāo)。在肝炎病毒和愛滋病毒感染中，CD169的表達與病毒的傳播和清除有關(guān)。因此，檢測CD169在病毒感染中的表達水平可以幫助了解病毒感染的程度和病情。圖2 CD169+髓細(xì)胞對先天免疫和適應(yīng)性免疫不同細(xì)胞亞群的潛在影響2。CD169+的表達是由病毒感染后的I型IFN信號誘導(dǎo)，啟動下游IFN途徑，促進病毒滴度控制和適應(yīng)性免疫細(xì)胞啟動和募集。有研究顯示，外周血單核細(xì)胞CD169的檢測可以作為COVID-19高敏及快速篩查的方法3。圖3 根據(jù)疾病分期和SARS-CoV-2 RT-PCR結(jié)果，與健康獻血者相比，新冠肺炎患者單核細(xì)胞CD169的表達3。方框圖A-C總結(jié)了健康獻血者（HBD，n=25，綠點）與新冠肺炎患者早期（A，黑點）、晚期（B，藍點）或無癥狀（C，紅點）的CD169指數(shù)水平（單核細(xì)胞與淋巴細(xì)胞信號的比率）與RT-PCR結(jié)果的比較；藍線表示陽性閾值（3.5）。圖D計算每組的ROC曲線，然后計算3.5閾值下的靈敏度、特異性、PPV(positive predictive value)和NPV（negative predictive value）。CD64是一種Fcγ受體，也稱為FcγRI。CD64主要表達在單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞的表面，可以結(jié)合抗體的Fc部分，并在體內(nèi)介導(dǎo)胞吞作用和抗體介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用。CD64的表達水平可以反映細(xì)菌或真菌感染的嚴(yán)重程度，CD64感染指數(shù)是一種用于評估感染嚴(yán)重程度的生物標(biāo)志物。在臨床上，CD64感染指數(shù)已被廣泛應(yīng)用于評估感染的早期診斷、疾病監(jiān)測和預(yù)后評估4。通過流式細(xì)胞術(shù)檢測CD169與CD64的表達可以幫助急診科對感染類型的鑒別進行臨床研究評估5。圖4 三組不同患者nCD64和mCD169的表達差異5。圖A 第一組（無感染）、第二組（細(xì)菌感染）和第三組（病毒感染）中性粒細(xì)胞上CD64的表達。圖B 對于相同的三組，CD169在單核細(xì)胞上的表達。數(shù)據(jù)以平均誤差和標(biāo)準(zhǔn)誤差表示。使用t檢驗計算各組之間的p值，如果p≤0.05，則顯示顯著差異。MFI表示平均熒光強度。HLA-DR是人類白細(xì)胞抗原中的一種MHC II分子，主要在抗原呈遞細(xì)胞（如樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、）表面表達，參與調(diào)節(jié)T細(xì)胞免疫應(yīng)答。在感染疾病中，HLA-DR的表達水平可以發(fā)生變化6-7，主要表現(xiàn)為以下兩種情況：增加：HLA-DR的表達增加通常發(fā)生在早期感染階段，是機體對感染的一種免疫反應(yīng)。感染時，免疫細(xì)胞受到刺激后會釋放促炎性因子，這些因子會刺激抗原呈遞細(xì)胞表達HLA-DR，從而引發(fā)T細(xì)胞免疫應(yīng)答。HLA-DR的增加也可以作為評估感染早期診斷和嚴(yán)重程度的生物標(biāo)志物。降低：HLA-DR的表達降低則常常發(fā)生在感染的晚期階段，是機體免疫功能的抑制反應(yīng)。在感染后的幾天或幾周，免疫細(xì)胞受到長期的刺激和激活，容易導(dǎo)致抗原呈遞細(xì)胞功能異常和免疫耗竭。這時，HLA-DR的表達通常會下降，表明機體的免疫反應(yīng)受到了抑制。HLA-DR的降低也可以作為評估感染后免疫抑制狀態(tài)的生物標(biāo)志物。為了幫助研究者更及時有效地對感染早期的免疫應(yīng)答進行評估，從而幫助鑒別細(xì)菌和病毒感染，貝克曼庫爾特也推出了一款3色的髓系活化檢測試抗體組合(貨號C63854)*用于外周血的髓系活化標(biāo)志物進行檢測。該試劑方案無需進行補償操作，支持免洗檢測，檢測過程便捷高效一步到位。除了可用幫助區(qū)分細(xì)菌感染和病毒感染之外，還于以下領(lǐng)域的研究：抗生素耐藥性：感染源和感染性質(zhì)識別錯誤問題嚴(yán)重，易導(dǎo)致抗生素濫用和機體耐藥性8。利用nCD64快速識別細(xì)菌感染，將有助于生物標(biāo)志物的研究和新抗生素的開發(fā)9。病毒性疾病進展：髓系細(xì)胞活化標(biāo)志物（CD169）已廣泛應(yīng)用于病毒性疾病的進展監(jiān)測和病毒清除，如HIV和肺部病毒感染，包括COVID-19 10-13。干擾素信號傳導(dǎo)：干擾素是一類細(xì)胞因子介質(zhì)，在感染時向細(xì)胞免疫系統(tǒng)報警。I型和II型干擾素對髓樣細(xì)胞的作用取決于炎癥刺激程度13-14。自身免疫性炎癥性疾病：研究表明，在RA、SLE、干燥綜合征等系統(tǒng)性自身免疫性疾病出現(xiàn)的慢性炎癥中，干擾素介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)等重要作用15。如果您對這個方案感興趣請點擊左下角“閱讀原文”與我們聯(lián)系，或者聯(lián)系貝克曼庫爾特的業(yè)務(wù)代表了解更多信息！ ● 參考文獻： 1.Bourgoin P, Biéchelé G, Ait Belkacem I, Morange PE, Malergue F. Role of the interferons in CD64 and CD169 expressions in whole blood: Relevance in the balance between viral- or bacterial-oriented immune responses. Immun Inflamm Dis. 2020;8(1):106-123.2.Herzog S, Fragkou PC, Arneth BM, Mkhlof S, Skevaki C. Myeloid CD169/Siglec1: An immunoregulatory biomarker in viral disease. Frontiers in Medicine. 2022;9.3.Michel M, Malergue F, Belkacem IA, Bourgoin P, Morange PE, Arnoux I, Miloud T, Million M, Tissot-Dupont H, Mege JL, Busnel JM. An ultra-sensitive, ultra-fast whole blood monocyte CD169 assay for COVID-19 screening. medRxiv. 2020 Oct 26:2020-10.4.Ajmani S, Agarwal V, Gurjar M. State of Globe: Neutrophil CD64: Is It a Reliable Biomarker for Sepsis? J Glob Infect Dis. 2018 Apr-Jun;10(2):33-34.5.Bourgoin P, Soliveres T, Ahriz D, Arnoux I, Meisel C, Unterwalder N, Morange PE, Michelet P, Malergue F, Markarian T. Clinical research assessment by flow cytometry of biomarkers for infectious stratification in an Emergency Department. Biomarkers in Medicine. 2019 Nov;13(16):1373-86.6.Juskewitch, J.E., Abraham, R.S., League, S.C., Jenkins, S.M., Smith, C.Y., Enders, F.T., Grebe, S.K., Carey, W.A. and Huskins, W.C., Monocyte HLA-DR expression and neutrophil CD64 expression as biomarkers of infection in critically ill neonates and infants. Pediatric research,2015; 78(6), pp.683-690.7.Gatti, A., Fassini, P., Mazzone, A., Rusconi, S., Brando, B. and Mistraletti, G., Kinetics of CD169, HLA-DR, and CD64 expression as predictive biomarkers of SARS-CoV2 outcome. Journal of Anesthesia, Analgesia and Critical Care, 2023;3(1), pp.1-10.8.Shallcross LJ, Davies DS. Antibiotic overuse: a key driver of antimicrobial resistance. Br J Gen Pract. 2014 Dec;64(629):604-5.9.Ajmani S, Agarwal V, Gurjar M. State of Globe: Neutrophil CD64: Is It a Reliable Biomarker for Sepsis? J Glob Infect Dis. 2018 Apr-Jun;10(2):33-34.10.Akiyama H, Ramirez NP, Gibson G, et al. 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2022-05-30 11:01:25【免費直播】流式細(xì)胞術(shù)1小時帶你弄懂，助你攻克實驗難題！: 單細(xì)胞樣本制備老失敗？流式實驗得到數(shù)據(jù)不可靠？流式圖不知道怎么分析？「全線賦能“沃”的實驗」之實驗方法實戰(zhàn)教程直播第四期將帶來《流式細(xì)胞術(shù)》從單細(xì)胞制備到流式細(xì)胞術(shù)，理論+實例帶你快速get到其中的難點要點直播時間5月31日（周二）19：00報名方式識別上方二維碼，立即免費報名主題：單細(xì)胞懸液樣本的分類及制備單細(xì)胞懸液樣本類型制備注意事項制備方法實例講師：馮啟崢瑞沃德高級產(chǎn)品方案經(jīng)理，專注動物傳染病學(xué)和細(xì)胞與分子免疫學(xué)研究多年，在動物疫苗研發(fā)、CRISPR的原核細(xì)胞應(yīng)用方面有著較為豐富的經(jīng)驗，致力于為客戶提供專業(yè)的細(xì)胞與分子生物研究方案。主題：流式細(xì)胞術(shù)的原理及應(yīng)用儀器基本結(jié)構(gòu)解析實驗方法實操講解技術(shù)應(yīng)用介紹講師：方晟昆明理工大學(xué)碩士研究生，已發(fā)表SCI論文4篇，在載體構(gòu)建、藥物活性篩選、腫瘤模型構(gòu)建、單細(xì)胞數(shù)據(jù)分析等方面有著豐富的經(jīng)驗，研究方向主要是抗腫瘤藥物的抗癌機理和單細(xì)胞測序分析。上期直播間互動問題這次我們?nèi)繛樾』锇榻獯?、做外周神經(jīng)損傷的小鼠能活多久？如何飼養(yǎng)？外周神經(jīng)損傷一般不會造成動物的死亡，但一些特殊情況會影響動物的存活率，比如為了避免在手術(shù)部位引起不良組織炎癥，我們應(yīng)該盡量縮短手術(shù)時間，如果手術(shù)部位意外出血，要用棉簽適當(dāng)按壓。如果出血沒有停止，就不要對這只動物進行進一步的實驗。術(shù)后動物應(yīng)該放進干凈的鼠籠并分籠飼養(yǎng)，注意保溫。2、脊髓損傷造模后，動物出現(xiàn)功能障礙不能自主排尿該如何護理？每日按壓排尿3次，以防泌尿系統(tǒng)感染；連續(xù)3天，每天兩次向腹腔注射相同劑量青霉素預(yù)防感染。3、使用纖維蛋白膠修復(fù)的是外周神經(jīng)損傷的哪個類型或者說等級呢?纖維蛋白膠可以應(yīng)用于橫斷的神經(jīng)，幫助受傷神經(jīng)的近端和遠端殘端緊密對齊，是神經(jīng)縫合技術(shù)的一種替代方式。4、坐骨神經(jīng)擠壓的結(jié)扎力度如何把控？有一些文獻上會使用帶有力值的工具進行擠壓神經(jīng)，如果我們沒有這類的工具，可以使用血管夾對神經(jīng)進行夾持，保證力度的一致性。5、有專門評估大小鼠前肢抓取能力的行為學(xué)實驗嗎?針對于前肢的抓取能力，爪抓力測試儀可以測動物前肢，后肢的抓力，另外如果是判斷動物前肢抓取食物的精細(xì)運動，可以用樓梯式抓取測試儀來進行。6、目前好像2D步態(tài)分析居多，慢慢也看到了3D步態(tài)分析，兩者相比各自有什么優(yōu)缺點呢?步態(tài)沒有2D、3D的區(qū)別，國內(nèi)使用較多的步態(tài)有2種：第一種是依靠壓力感應(yīng)可以生成動物腳掌受力的情況，判斷動物的損傷情況；第二種是通過視頻記錄動物足部在運動時的軌跡，通過足部的運動過程計算生成動物活動過程中四肢運動的各項指標(biāo)來判斷動物的損傷情況。這兩種方法從2個不同的方面完善了步態(tài)的分析數(shù)據(jù)，但實際上無法互相替代。一般來說大鼠步態(tài)用第一種壓力感應(yīng)測試的會多一些，小鼠步態(tài)則用視頻記錄的多一些。所謂的3D步態(tài)是通過從側(cè)面拍攝動物運動時的腿部活動，對動物的步態(tài)運動進行更為細(xì)致的評估，與傳統(tǒng)步態(tài)記錄的是2個維度的信息，無法進行替代。由于需要識別動物腿部的關(guān)節(jié)，目前無法與足底步態(tài)很好的融合結(jié)果。7、這種轉(zhuǎn)棒實驗是可以大小鼠通用的嗎？如何檢測到掉落？轉(zhuǎn)棒大小鼠主機通用，但是跑道是需要替換的。設(shè)備通過紅外感應(yīng)，電子感應(yīng)等自動檢測動物掉落情況，停止計時。8、外周神經(jīng)損傷會導(dǎo)致疼痛致敏，在模型檢測中可以用什么疼痛檢測方法呢？主要看測痛的部位，機械痛一般可以用vonfery針或電子測痛儀來進行測試，針對不同部位也有面部疼痛測試儀（三叉神經(jīng)），壓感測痛儀（背部，較大的關(guān)節(jié)），鉗式測痛儀（整個腳，細(xì)小的關(guān)節(jié)），熱痛一般測試動物足底或尾部，使用紅外測痛儀或者甩尾測痛儀。9、怎么手動排尿？按摩膀胱。10、每天需要按摩多久？術(shù)后需輕輕按摩擠壓膀胱進行排尿，每次按摩到排空，每天至少三次。11、不規(guī)則梯和錯步分析儀是不是指一個東西啊？是一種類型的儀器，不同廠家的名稱，測試方法，輸出的指標(biāo)會略有不同。12、轉(zhuǎn)棒實驗一直做不出差異怎么辦？可能有2種原因：①測試時動物已經(jīng)恢復(fù)到與正常鼠一致的水平，所以做不出差異。解決方法：將轉(zhuǎn)棒測試時間提前。②測試難度過于簡單或者過于困難，導(dǎo)致差異很小，從而統(tǒng)計分析結(jié)果無差異。解決方法：調(diào)整實驗難度，直到可以做出差異的結(jié)果。新型轉(zhuǎn)棒儀除了原先的勻速和勻加速以外還增加了階段加速等測試方法，實驗難度有了更大的調(diào)整空間。13、兩爪及四爪攀爬實驗有合適的實驗設(shè)備嗎？不規(guī)則梯結(jié)合自制實驗設(shè)備。14、脊髓損傷后有哪些評估手段？脊髓損傷后可通過行為學(xué)對運動及感覺進行評估。BBB法：一般用于觀察大鼠后肢行走及肢體活動，評分分為三個部分，0-7分評判動物后肢關(guān)節(jié)活動情況，8-13分評判后肢步態(tài)及協(xié)調(diào)功能，14-21分評判運動中爪的精細(xì)活動；BMS評分是在BBB評分基礎(chǔ)上針對小鼠的運動特點做出了完善和修改，是專門用于小鼠后肢功能的評分方法。其他運動相關(guān)行為學(xué)：步態(tài)分析系統(tǒng)用于評估步態(tài)動力學(xué)、協(xié)調(diào)性分析、平衡性分析等；轉(zhuǎn)棒儀可評估動物的運動協(xié)調(diào)性；行走障礙分析儀可分析簡單步態(tài)及運動協(xié)調(diào)性等。感覺功能相關(guān)行為學(xué)：Vonfrey測痛針用于評估對觸碰的敏感性；冷熱盤用來測試動物對冷熱刺激的敏感度。15、平衡木也可以做小鼠嗎？有小鼠平衡木可以進行小鼠實驗。16、請問外周神經(jīng)損傷后有哪些手段可以評價感覺功能的損失？感覺功能相關(guān)行為學(xué)：機械痛一般可以用vonfery針或電子測痛儀來進行測試，評估對觸碰的敏感性，針對不同部位也有面部疼痛測試儀（三叉神經(jīng)），壓感測痛儀（背部，較大的關(guān)節(jié)），鉗式測痛儀（整個腳，細(xì)小的關(guān)節(jié)），熱痛一般測試動物足底或尾部，使用紅外測痛儀（用于量化對小鼠和大鼠后爪輻射或紅外熱刺激的熱閾值的方法）或者甩尾測痛儀（一種基于對嚙齒動物中熱刺激回避反應(yīng)的潛伏期測量的疼痛實驗）。↓↓本期直播記得預(yù)約噢，全程免費還可進群輕松獲取后續(xù)科研直播課信息以及更多豐富學(xué)術(shù)干貨~▼分享下圖到朋友圈，讓更多師兄師弟師姐師妹get到流式實驗干貨，精彩不容錯過喲~

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